Кафедра молекулярной биологии
Пущинского филиала МГУ им. М. В. Ломоносова

ПРОГРАММА КУРСА

МЕТОДЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ

Направление: 510600 - Биология

Специализация: 51611 - Биохимия и молекулярная биология

Составители:
 доктор биологических наук, профессор
Николай Иванович Матвиенко
и доцент
Людмила Алексеевна Железная

ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА

    

ПРОГРАММА

  1. Основной метод, предпосылки и этапы развития генной инженерии.

  2. Методы выделения ДНК и матричных РНК из клеток. Электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот. Импульсный электрофорез.

  3. Явление модификации – рестрикции. Метилирование ДНК. Биологическая роль метилирования. Системы модификации – рестрикции I,II, III и IV типов.

  4. Эндонуклеазы рестрикции II типа. Определение последовательности сайта узнавания. Метод ферментативной селекции рекомбинантных ДНК.

  5. Использование эндонуклеаз рестрикции типа IIS. Модификационные профили бактериальных геномов. Защита фаговых и плазмидных ДНК от систем рестрикции.

  6. Клонирование генов систем модификации – рестрикции. Методы “венгерского трюка”, “троянского коня” и “SOS отклика”. Системы mcr и mrr ограничения метилированной ДНК.

  7. Физическое картирование молекул ДНК. Блотинг – гибридизация нуклеиновых кислот. Редкое расщепление молекул ДНК методом “пяты Ахилла”. Пептид – нуклеиновые кислоты и их использование в методе “пяты Ахилла”.

  8. Методы соединения фрагментов ДНК. Свойства ДНК – лигаз и концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы. Полинуклеотид – киназа и мечение 5¢ -концов ДНК.

  9. Репликация ДНК in vitro. Свойства ДНК – полимераз. Полимеразная цепная реакция.

  10. Физиология и генетика фага l . Генная карта l . Транскрипционная программа. Установление лизогенного состояния. Специфическая трансдукция. Репликационная программа. Упаковка ДНК в головку фага. Общая рекомбинация.

  11. Векторные мутанты l . Spi – фенотип. Векторы внедрения и замещения. Лизогенизирующие векторы. Космиды, фагмиды, лорики.

  12. Плазмидные векторы. Группы несовместимости. Репликация плазмид. Плазмиды серии pBR. Векторы для прямой селекции рекомбинантов. Плазмиды с терморегулируемой репликацией. Векторы для клонирования промоторов и терминаторов, для секреции чужеродных белков из клетки.

  13. Жизненный цикл нитчатого фага М13. Векторные мутанты на основе М13. Цветная идентификация рекомбинантных клонов.

  14. Максимализация экспрессии чужеродных генов в E.coli .Структура промотора, регулируемые промоторы. Гибридные опероны. Слитные белки. Метод Пташне оптимизации расстояния от последовательности Шайна–Дальгарно до инициаторного кодона. Внутриклеточный протеолиз.

  15. Банки генов. Идентификация рекомбинантных клонов. Бинарные векторные системы. Векторы для клонирования в дрожжах (YAC). Клонотеки генов.

  16. Техника “хождения” по хромосомам. Прыжковые и сцеплённые библиотеки. “Бегущие “ векторы. Геномные проекты.

  17. Клонирование кДНК. Обратная транскриптаза. Техника клонирования кДНК по Бергу.

  18. Фагово – специфичная транскрипция. Векторы для экспрессии с использованием Т7, Т3 и SP6 РНК – полимераз. Сопряжённая транскрипция – трансляция in vitro.

  19. Белковая инженерия. Сайт – специфический мутагенез.

  20. Анализ первичной структуры ДНК и РНК.

  21. Регуляция активности генов антисмысловыми РНК и пептиднуклеиновыми кислотами. Определение функции гена методом “вышибания” гена из хромосомы за счёт рекомбинации с мутантным введенным геном.

ЛИТЕРАТУРА

  1. Маниатис Т., Э. Фрич, Дж. Сэмбрук Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984.

  2. Клонирование ДНК. Методы. Под ред. Д. Гловера, М.: Мир, 1988.

  3. Новое в клонировании ДНК. Методы. Под ред. Д. Гловера, М.: Мир, 1989.

  4. Анализ генома. Под ред. К. Дейвека, М.: Мир, 1990.