Кафедра молекулярной биологии
Пущинского филиала МГУ им. М. В. Ломоносова

ПРОГРАММА КУРСА

БИОСИНТЕЗ БЕЛКА

Направление: 510600 - Биология

Специализация: 51611 - Биохимия и молекулярная биология

Составитель: доктор биологических наук, профессор
Лев Павлович Овчинников


ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА

    Курс "Биосинтез белка" является составной частью общего курса молекулярной биологии. Курс рассчитан на студентов, занимающихся по программе магистерской подготовки, а также на аспирантов, специализирующихся в области молекулярной биологии, и научных сотрудников, начинающих работать в этой области.

    В курсе дается описание основных компонентов белок-синтезирующего аппарата, молекулярного механизма сложного многостадийного процесса белкового синтеза, специфических особенностей этого процесса у про- и эукариот; рассматривается действие антибиотиков и токсинов. Подробно анализируются механизмы регуляции трансляции в нормальных клетках и при их заражении фагами и вирусами. Особое внимание уделяется описанию классических экспериментов, заложивших основы наших знаний по билковому синтезу.

Общий объем курса: 30 часов

Форма проверки знаний: экзамен


ПРОГРАММА

  1. Общая характеристика процесса трансляции (биосинтеза белка).
  2. а). Уравнение суммарной химической реакции.

    б). Энергетическое обеспечение процесса трансляции.

    в). Компоненты аппарата трансляции.

    г). Полярность трансляции.

  3. Бесклеточные системы белкового синтеза.
  4. Три стадии химической реакции биосинтеза белка:
  5. а). Активация аминокислот.

    б). Акцептирование аминокислотных остатков на тРНК.

    в). Последовательное замещение тРНК на аминоацил-тРНК в рибосоме. Ферменты, катализирующие отдельные реакции.

  6. Активация аминокислоты с помощью АТР.
    Химия процесса. Тип образующейся химической связи. Обратимость реакции и способ достижения необратимости. Ферменты, их выделение, названия. Специфичность ферментов по отношению к различным аминокислотам. Аминоацил-аденилат-ферментный комплекс.
  7. Акцептирование аминокислотного остатка на тРНК.
  8. а). Адапторная гипотеза Крика (1955г.). Принцип комплементарности как основа гипотезы.

    б). Открытие тРНК и процесса акцептирования аминокислот (Хогланд и Замечник, 1957г.; Огата и Нахара, 1957г.)

    в). Общая характеристика первичной структуры тРНК: длина цепи, универсальная 3’–концевая последовательность.

    г). Реакция акцептирования аминоацила. Химия процесса. Тип образующейся химической связи. Значение ССА конца тРНК. Ферменты, участвующие в акцептировании, их название. Единство обеих ступеней процесса – активации и акцептирования – как реакций, катализируемых одним ферментом.

  9. Экспериментальная проверка адапторной гипотезы.
  10. а). Аминоацил - тРНК как форма поступления аминокислоты в рибосому.

    б). Специфичность тРНК по отношению к различным аминокислотам. Узнавание ферментами индивидуальных тРНК. Разделение индивидуальных тРНК. О гетерогенности тРНК с одинаковой специфичностью к аминокислоте (множественность изоакцепторных тРНК).

    в). Окончательное доказательство адапторной гипотезы: опыт с превращением цистеинил-тРНК в аланил-тРНК (Шапвиль, Липман и Бензер, 1962г.)

    г). Роль аминоацил-тРНК-синтетаз в адапторном механизме.

  11. Изучение структуры тРНК.
  12. а). Первичная структура, минорные нуклеотиды.

    б). Универсальность макромолекулярной структуры тРНК. Вторичная структура: "клеверный лист", двуспиральные и односпиральные участки.

    в). Третичная структура тРНК.

    г).Локализация функциональных центров на молекуле тРНК.

    д). Синтез и процессинг тРНК.

  13. Аминоацил –тРНК-синтетазы.
  14. а). Функциональные центры, субъединичная структура. Мультиферментные комплексы синтетаз у эукариот.

    б). Специфичность аминоацил-тРНК-синтетаз по отношению к аминокислоте и тРНК; ошибки при аминоацилировании и механизмы коррекции.

    в). Синтез алармонов.

  15. Общие свойства генетического кода.
  16. а). Понятие о кодовом отношении, о неперекрываемости кодонов, отсутствии запятых, вырожденности и универсальности генетического кода.

    б). Экспериментальное доказательство неперекрываемости кодонов с помощью точечных мутаций.

    в). Экспериментальное доказательство триплетности кода и отсутствия запятых с помощью мутаций, индуцированных акридиновыми красителями.

  17. Расшифровка генетического кода.
  18. а). Искусственные полирибонуклеотиды как матрицы для синтеза полипептидов. Открытие Ниренбергом и Маттеи эффекта полиуридиловой кислоты (1961г.)

    б). Принцип метода экспериментальной расшифровки состава кодонов при использовании искусственных матричных полирибонуклеотидов. Использование гомополимеров (кодоны UUU, CCC, AAA). Использование гетерополимеров различного состава (пример с поли (UC)). Состав кодонов.

    в). Принцип метода экспериментальной расшифровки последовательности нуклеотидов в кодонах. Открытие Ниренберга и Ледера (1964г.): связывание аминоацил-тРНК с тринуклеотидами на рибосоме. Составление кодовой таблицы.

    г). Окончательное подтверждение строения и функции кодонов путем использования синтетическх матриц заданной регулярной нуклеотидной последовательности (Хорана, 1966г.). Окончательная кодовая таблица.

    д). Вырожденность генетического кода и некоторые закономерности этой вырожденности; универсальность и некоторые особенности генетического кода митохондрий.

    ж). Перекодирующие сигналы (изменение значения кодона, сдвиги рамки считывания, пропуск нуклеотидов при считывании).

  19. Гипотеза Крика о нестрогом соответствии
    при кодон-антикодоновом спаривании (1966г.); поправки к правилам Крика.
  20. Открытие информационной (матричной РНК).
  21. а). Несоответствие нуклеотидного состава тотальной РНК составу ДНК. Корреляция нуклеотидного состава небольшой фракции РНК с составом ДНК (Белозерский и Спирин, 1957-1958гг).

    б). "Фагово-специфическая" РНК, ее быстрая обмениваемость (нестабильность и быстрый синтез), ДНК-подобный состав (Фолькин и Астрахан, 1956-1958гг.).

    в). Обнаружение нестабильной РНК, несущей информацию от генов к рибосомам при фаговой инфекции, опыт Бреннера, Жакоба и Мезельсона (1961г.) по центрифугированию в градиенте плотности CsCl.

    г). Обнаружение меченой "фагово-специфической" РНК путем центрифугирования в сахарозном градиенте (до и после депротеинизации); опыт Гро и Уотсона (1961г.).

    д). Обнаружение меченой мРНК в нормальных клетках путем центрифугирования в сахарозном градиенте после пульсовой метки (до и после депротеинизации). Принцип метода пульсовой метки.

  22. Свойства и процессинг матричных РНК.
  23. а). Время жизни мРНК в клетке и способ его определения.

    б). Полицистронные и моноцистронные мРНК; транслируемые и нетранслируемые области в мРНК;

    в). Кэпирование мРНК эукариот; значение кэп-структуры для функционирования мРНК.

    г). Полиаденилирование мРНК эукариот; сигналы ядерного и цитоплазматического полиаденилирования; значение полиаденилирования для стабильности и активности мРНК.

    д). Интроны в мРНК и их предполагаемое значение; последовательность нуклеотидов на границе экзон/интрон (правило Шамбона); сплайсинг мРНК; виды сплайсинга; последовательность химических реакций при сплайсинге; малые ядерные РНП и их участие в сплайсинге.

    ж). Редактирование мРНК.

  24. Информосомы как форма существования мРНК в эукариотической клетке.
    Классы информосом, их внутриклеточная локализация, состав и особенности строения.
  25. Рибосома и ее структура.
  26. а). Локализация рибосом в клетке. Свободные и мембрансвязанные рибосомы; микросомы. Принцип препаративного выделения рибосом.

    б). Прокариотический и эукариотический типы рибосом. Рибосомы митохондрий и хлоропластов.

    в). Размер, внешний вид и подразделение рибосом на две субчастицы. Морфология рибосомных субчастиц. Объединение субчастиц в целую рибосому.

    г). Рибосомные РНК. Их распределение по субчастицам. Первичная и вторичная структура. Гомология первичной структуры pРНК разных организмов и систематика. Структурные домены и компактная самоукладка молекул РНК.

    д). Рибосомные белки. Разнообразие, номенклатура. Первичные структуры. Пространственные структуры. Белковые комплексы. Взаимодействие с рибосомными РНК.

    ж). Взаиморасположение рибосомной РНК и белков. Периферическое расположение белков на ядре РНК. Топография белков: определение соседствующих белков, измерение расстояний между белками, иммунная электронная микроскопия. Топография РНК: иммунная электронная микроскопия, привязка к топографии белков. Четвертичная структура.

  27. Структурные превращения рибосом.
  28. а). Диссоциация рибосом на субчастицы: факторы, способствующие и противодействующие диссоциации.

    б). Разворачивание субчастиц; кооперативность.

    в). Разборка субчастиц; стадии разборки; кооперативность.

    г). Самосборка рибосом. Стадии сборки. “Карта” сборки.

    д). Сборка рибосом в клетке.

  29. Общая характеристика процесса трансляции в рибосоме. Динамическая модель работы рибосомы (Уотсон, 1964-1965гг.) Экспериментальная проверка следствий из динамической модели: два состояния пептидил-тРНК на рибосоме; передвижение мРНК.
  30. Функциональные центры рибосомы и их локализация.
  31. а). Функции связывания: связывание и удержание мРНК, удержание пептидил-тРНК, связывание аминоацил-тРНК, связывание белковых факторов трансляции и GTP.

    б). Каталические функции: GTP-аза, пептидилтрансфераза.

    в). Функции перемещения лигандов (транслокация).

  32. Инициация трансляции.
  33. а). Инициация трансляции у прокариот: инициирующие кодоны, инициаторная тРНК, белковые факторы инициации. Последовательность событий в процессе инициации.

    б). Особенности процесса инициации у эукариот: факторы инициации эукариот. Инициация по кэп-зависимому сканирующему механизму: узнавание кэп-структуры и сканирование лидерной последовательности мРНК; гидролиз АТР. Особенности инициации мРНК, не содержащих кэп-структуры (инициация по механизму внутреннего входа рибосом).

    в). Инициация в бесклеточных системах с синтетическими матрицами без инициирующих кодонов.

  34. Элонгация полипептидных цепей.
  35. а). Элонгация у прокариот. Факторы элонгации. Последовательность событий в процессе элонгации: поступление аминоацил-тРНК в рибосому, транспептидация, транслокация. Роль гидролиза GTP.

    б). Особенности элонгации у эукариот.

    в). Бесфакторная элонгация и безматричная элонгация в бесклеточной системе.

  36. Терминация трансляции.
  37. а). Кодоны терминации.

    б). Белковые факторы терминации.

    в). Последовательность событий в процессе терминации.

    г). Терминация трансляции при отсутствии терминирующих кодонов; роль 10S РНК в такой терминации.

  38. Ложное кодирование.
  39. Основные типы ложного спаривания; факторы, способствующие ложному кодированию. Кинетические механизмы ложного кодирования и его коррекции.

  40. Полирибосомы.
  41. Компартментализация белков эукариотического аппарата трансляции на поли рибосомах.
  42. Взаимодействие рибосомы и растущего пептида с мембраной. Ко-трансляционный трансмембранный транспорт.
  43. а). Синтез белков свободными и мембрано-связанными полирибосомами.

    б). Способы соединения рибосомы с мембраной.

    в). N-концевая сигнальная последовательность растущего полипептида.

    г). Сигнал-узнающие частицы и их мембранные рецепторы.

  44. Ко-трансляционные модификации белка:
    деформилирование, деметионилирование, отщепление N-концевой последовательности, образование дисульфидных связей, N-гликозилирование.
  45. Посттрансляционный транспорт, компартментализация и модификация белков.
  46. Механизм действия антибиотиков на белковый синтез:
  47. а) пуромицина;

    б) эдеина, ауринтрикарбоновой кислоты;

    в) аминогликозидов, тетрациклинов, тиострептона;

    г) хлорамфеникола, линкомицина, анизомицина;

    д) эритромицина, циклогексимитда;

    ж) кирромицина;

    з) фусидовой кислоты.

  48. Механизм действия бактериальных и растительных токсинов:
  49. а) колицина Е3, альфа-сарцина;

    б) дифтерийного токсина, экзотоксина А;

    в) дизентерийного токсина;

    г) рицина, абрина, модецина, трихосантина, рибосомоинактивирующих белков растений.

    д). Направленные токсины и перспективы их применения в медицине.

  50. Регуляция трансляции РНК фага MS2.
  51. Регуляция синтеза рибосомных белков бактерий на уровне трансляции.
  52. Посттранскрипционная регуляция биосинтеза белка у эукариот.
  53. а). Регуляция на уровне процессинга мРНК.

    б). "Маскирование" мРНК в цитоплазме.

    в). Дискриминация мРНК при трансляции и роль лидерной последовательности.

    г). Регуляция скорости инициации трансляции.

    д). Регуляция скорости элонгации.

    ж). Регуляция терминации.

    з). Регуляция деградации мРНК.


    ОСНОВНАЯ ЛИТЕРАТУРА

    1. Дж. Уотсон. Молекулярная биология гена, М., "Мир", 1973.
    2. А. С. Спирин. Молекулярная биология. Структура рибосомы и биосинтез белка М., "Высшая школа", 1986.

    ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ЛИТЕРАТУРА

    1. М. Ичас. Биологический код, М., "Мир", 1971.
    2. Ф. Шапвиль, А-Л. Энни. Биосинтез белка, М., "Мир", 1977.
    3. Л. Л. Киселев, А. Д. Вольфсон. Аминоацил-тРНК-синтетазы высших эукариот. Успехи биологической химии. Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН, 1995, Т.35, С.3-65.
    4. В. С. Высоцкая, М. Б. Гарбер. Регуляция экспрессии генов рибосомных белков Escherichia coli. Успехи биологической химии. Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН, 1995, Т.35, С.67-95.
    5. А. С. Спирин. Регуляция трансляции мРНК-связывающими факторами у высших эукариот. Успехи биологической химии. Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН, 1996, Т.36, С.3-48.