Кафедра молекулярной биологии
Пущинского филиала МГУ им. М. В. Ломоносова


ПРОГРАММА КУРСА

ФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ В МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ

Направление: 510600 - Биология

Специализация: 510611 - Биохимия и молекулярная биология

Составитель: доктор физико-математических наук, профессор
Игорь Николаевич Сердюк


ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА

    Курс рассчитан, в основном, на студентов, занимающихся по программе магистерской подготовки, и аспирантов, специализирующихся в области молекулярной биологии.

    В курсе дается систематическое изложение основных методов изучения структуры макромолекул как на уровне атомарного разрешения (рентгеноструктурный и нейроструктурный анализ, ЯМР), так и на уровне молекулы как целого (гидродинамические методы).

    Изложение каждого метода сопровождается многочисленными примерами, иллюстрирующими их достоинства и недостатки.

Общий объем курса: 27 часов

Форма проверки знаний: экзамен



ПРОГРАММА

  • 1. Введение (3 часа)

    Общая характеристика физических методов изучения структуры биологических макромолекул в растворе, на подложке и в кристалле. Их роль и место в современной структурной молекулярной биологии.


  • 2. Явления, связанные с внутренним трением в растворах биологических макромолекул (9 часов)

    Понятие гидродинамически эквивалентной сферы и гидродинамически эквивалентного эллипсоида. Коэффициент поступательного трения и его связь с размерами и формой частиц. Формула Стокса. Формула Перрена. Зависимость константы поступательного трения от молекулярной массы в ряду частиц разной формы.

    Метод поступательной диффузии и его использование для анализа конформационного состояния биологических макромолекул. Первый и второй законы Фика. Зависимость коэффициента диффузии от молекулярной массы белков и нуклеопротеидов. Связь между константой диффузии и константой поступательного трения частицы. Формула Эйнштейна. Анализ конформационного состояния биологических макромолекул исходя из зависимости их коэффициента диффузии от молекулярной массы.

    Метод скоростной седиментации. Коэффициент седиментации и его связь с коэффициентом поступательного трения. Зависимость коэффициента седиментации от молекулярной массы белков и нуклеопротеидов. Анализ конформационного состояния биологических макромолекул из зависимости их константы седиментации, поправленной на архимедов фактор, от молекулярной массы.

    Оптические методы регистрации в диффузии и аналитическом ультрацентрифугировании: метод Филпота-Свенссона, интерференционный метод, абсорбционный метод. Краткое описание ультрацентрифуги, роторов, кювет.

    Определение молекулярной массы биологических макромолекул методом сочетания седиментации и диффузии. Первая формула Сведберга. Границы применимости. Классический метод седиментационного равновесия. Вторая формула Сведберга. Приближения к седиментационному равновесию. Метод Арчибальда. Метод Ифантиса.

    Равновесная седиментация в градиенте плотности. Дифференциальная седиментация.

    Вязкость. Характеристическая вязкость [h]. Сущность явления. Вязкость растворов сферических частиц. Формула Эйнштейна. Вязкость растворов жестких асимметричных по форме, сплошных частиц. Формула Симха. Зависимость характеристической вязкости белков и нуклеопротеидов от молекулярной массы. Вязкость растворов полимерных молекул. Конформация Гауссова клубка. Белки в гуанидингидрохлориде и мочевине. Зависимость [h] от молекулярной массы для белков в гуанидингидрохлориде и мочевине, возможность определения молекулярной массы белков в этих растворителях.

    Типы и конструкции вискозиметров. Градиентная зависимость вязкости. Вискозиметр Зимма. Вязкость ДНК.

    Совместное использование константы поступательного трения и вязкости. Формула Шераги-Манделькерна.

    Метод динамического двойного лучепреломления (эффект Максвелла). Ориентация макромолекул в гидродинамическом поле. Определение размеров, формы и гибкости макромолекул.

    Метод электрического двойного лучепреломления (эффект Керра). Ориентация макромолекул в электрическом поле. Определение размеров и формы макромолекул.


  • 3. Парциальный удельный объем нативных биологических макромолекул и его изменение при денатурации. Парциальный удельный объем многокомпонентных частиц (0,5 часа)

  • 4. Электронная микроскопия биологических макромолекул. Сканирующая туннельная электронная микроскопия. Криоэлектронная микроскопия (0,5 часа)

  • 5. Масспектроскопия и ее сочетание с жидкостной хроматографией и электронной ионизацией. Определение первичной структуры белков (0,5 часа)

  • 6. Ядерный магнитный резонанс (ЯМР). Понятие химического сдвига. ЯМР высокого разрешения белков и нуклеиновых кислот. Общие подходы к увеличению разрешения: сайт-специфическое изотопическое мечение и дейтерирование (1 час)

  • 7. Флуоресценция белков и нуклеиновых кислот. Флуоресцентная линейка (0,5 часа)

  • 8. Оптические методы изучения биологических макромолекул. Спектры кругового дихроизма в видимой и инфракрасной области (0,5 часа)

  • 9. Сканирующая микрокалориметрия. Изучение процесса денатурации глобулярных белков и нуклеиновых кислот (0,5 часа)

  • 10. Явления, связанные с рассеянием электромагнитного и нейтронного излучения в растворах биологических макромолекул (9 часов)

    Общая характеристика рассеяния света, рентгеновских лучей и нейтронов. Рассеяние света как рассеяние на "связанных" электронах, рассеяние рентгеновских лучей как рассеяние на "свободных" электронах, рассеяние нейтронов как рассеяние на ядрах. Основные физические следствия.

    Функция внутримолекулярной интерференции Дебая и ее свойства. Рассеяние на нулевой угол. Радиус инерции. Его связь с формой частицы и с распределением электронной (нейтронной) плотности внутри нее. Область формы. Общие законы спада кривой рассеяния для частиц разной формы (палочка, диск, гауссов клубок, компактные частицы). Метод сферических гармоник и его применение к восстановлению трехмерной структуры макромолекул.

    Рассеяние рентгеновских лучей. Формула Томпсона. Источники рентгеновского излучения (трубки, вращающиеся аноды, источники синхротронного излучения). Приемники рентгеновского излучения. Методы вариации контраста.

    Рассеяние света. Формула Реллея. Методы интерпретации экспериментальных данных. Рассеяние на малых и больших частицах. Метод Зимма. Проблема определения молекулярных масс и радиусов инерции больших биологических макромолекул. Изучение структуры ДНК. Методы вариации контраста.

    Рассеяние нейтронов. Нейтронные источники. Стационарные и пульсирующие реакторы. Мигающие источники. Малоугловые нейтронные спектрометры. Методы вариации контраста: метод H2O-D2O смесей, метод двойного и тройного изотопического замещения. Методы триангуляции. Метод спиновой вариации контраста. Биосинтетическое дейтерирование.

    Совместное использование рассеяния света рентгеновских лучей и нейтронов. Определение радиусов инерции компонентов и расстояний между их центрами тяжести в двухкомпонентных частицах. Совместное использование константы поступательного трения частицы и ее радиуса инерции.


  • 11. Рассеяние рентгеновских лучей и нейтронов на частично ориентированных биологических макромолекулах. Рентгенограммы ориентированной ДНК. Модель двойной спирали ДНК Крика-Уотсона. Модели Бейтса и Родли (0,5 часа)

  • 12. Дифракция лучей на кристаллической решетке. Закон Брегга-Вульфа.

    Рентгеноструктурный и нейтроноструктурный анализ белков и нуклеиновых кислот. Фазовая проблема. Изоморфное замещение. Выращивание кристаллов. Проблема определения структуры больших макромолекулярных комплексов. Безгрешен ли рентгеноструктурный анализ? (1 час)


  • 13. Динамическое рассеяние света (ДРС). Лазер и коррелятор как основные аппаратурные составляющие. Основные области применения ДРС: быстрое и точное определение коэффициентов поступательной диффузии макромолекул в растворе, определение скоростей направленного движения в растворах, изучение внутренних мод движений. Динамическое описание клеточных процессов (1 час)

  • 14. Заключение "Структура и функция комплементарны на молекулярном уровне" (Ф.Крик) (0,5 часа)


  • ЛИТЕРАТУРА

    1. В. Н. Цветков, В. Е. Эскин, С. Я. Френкель "Структура молекул в растворах", М., "Наука", 1964.

    2. Р. Мартин "Введение в биофизическую химию", М., "Мир", 1966.

    3. Ч. Тенфорд "Физическая химия биополимеров", М., "Мир", 1971.

    4. Т. Боуэн "Введение в ультрацентрифугирование", М., "Мир", 1973.

    5. Э. Маршелл "Биофизическая химия" тт. 1,2, М., "Мир", 1981.

    6. А. С. Спирин "Структура рибосомы и биосинтез белка", М., Высшая школа, 1986.

    7. Ч. Кантор, П. Шиммел "Биофизическая химия" тт. 1-3, М., "Мир", 1985.

    8. Ю. М. Останевич, И. Н. Сердюк "Нейтронографические исследования биологических макромолекул", "Успехи физических наук", т. 137, сс. 86-116, 1982.